Acidi boronici alternativi nella rilevazione del micolattone A/B mediante cromatografia su strato sottile (f

BMC Infectious Diseases volume 23, numero articolo: 495 (2023) Citare questo articolo

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Mycobacterium ulcerans è l'agente eziologico dell'ulcera di Buruli. La patologia della malattia da M. ulcerans è stata attribuita alla secrezione di una potente citotossina macrolidica nota come micolattone che svolge un ruolo importante nella virulenza della malattia. Il micolattone è un biomarcatore per la diagnosi di BU che può essere rilevato utilizzando la tecnica della cromatografia su strato sottile fluorescente (f-TLC). La tecnica si basa sulla derivatizzazione chimica del mycolactone A/B con acido 2-naftilboronico (BA) che agisce come chemosensore fluorogenico. Tuttavia, le interferenze di fondo dovute ai lipidi coestratti dai tessuti umani, in particolare con campioni clinici, insieme alla soggettività del metodo, richiedono un'indagine per trovare un'alternativa al BA.

Ventisei acidi arilboronici disponibili in commercio sono stati inizialmente selezionati come alternativi al BA utilizzando l'esperimento f-TLC. Sono state inoltre condotte misurazioni UV-vis per determinare gli spettri massimi di assorbimento degli addotti di micolattone A/B e acido micoboronico, seguite da un'indagine sulla capacità di potenziamento della fluorescenza della formazione di esteri boronici tra il micolattone A/B e i nostri tre prodotti boronici più promettenti acidi (BA15, BA18 e BA21). La tecnica LC-MS è stata utilizzata per confermare la formazione di addotti tra micolattone e acidi boronici. Inoltre, è stato condotto uno studio comparativo tra BA18 e BA utilizzando 6 campioni di pazienti BU confermati dalla reazione a catena della polimerasi (PCR).

Tre degli acidi boronici (BA15, BA18 e BA21) hanno prodotto intensità di banda fluorescente superiori a BA. Studi di complessazione condotti su cromatografia su strato sottile (TLC) utilizzando una soluzione 0,1 M dei tre acidi boronici e vari volumi di 10 ng/μL di micolattone sintetico compresi tra 1 µL – 9 µL corrispondenti a 10 ng – 90 ng hanno fornito risultati simili con micolattoni L'addotto BA18 emerge con le bande di fluorescenza più visibilmente intense. I massimi di assorbimento UV-vis (λmax) per il micolattone A/B libero sono stati osservati a 362 nm e i valori per gli addotti myco-BA15, mico-BA18 e mico-BA21 erano a 272 nm, 270 nm e 286 nm rispettivamente. Il comparabile λmax sperimentale di 362 nm per il micolattone A/B con il valore calcolato di Woodward-Fieser di 367 nm per la catena laterale degli acidi grassi del micolattone A/B dimostra che anche se si sono formati 2 boronati ciclici, solo il boronato del lato meridionale la catena con il cromoforo è stata eccitata mediante irradiazione a 365 nm. Esperimenti di fluorescenza hanno dimostrato che l'accoppiamento di BA18 con il micolattone A/B lungo gli 1,3-dioli migliora notevolmente l'intensità della fluorescenza a 537 nm. Per confermare la formazione dell'addotto mico-BA15 è stato utilizzato lo spettrometro di massa ad alta risoluzione (HR-MS). Infine, l'analisi f-TLC dei campioni dei pazienti con BA18 ha fornito intensità dell'addotto BA18 migliorate rispetto all'addotto BA originale.

Ventisei acidi boronici disponibili in commercio sono stati studiati come alternativi al BA, utilizzati nell'analisi f-TLC per la diagnosi di BU. Tre (3) di essi BA15, BA18 e BA21 hanno fornito profili di intensità della banda di fluorescenza superiori. Hanno fornito profili più facili da interpretare dopo la formazione dell'addotto di acido micoboronico e negli esperimenti con campioni clinici di pazienti con BA18. BA18, pertanto, è stato identificato come una potenziale alternativa al BA e potrebbe fornire una soluzione al problema dell'interferenza di fondo dei lipidi dei tessuti umani coestratti da campioni clinici attualmente associati all'uso del BA.

Rapporti di revisione tra pari

Il micolattone (ML), la prima citotossina macrolidica nota per essere prodotta dal patogeno umano Mycobacterium ulcerans (MU), è l'agente eziologico dell'ulcera di Buruli (BU) [1, 2]. È l'unico macrolide identificato nel genere Mycobacterium [3]. Nel 1965, Connor e collaboratori ipotizzarono che M. ulcerans fosse responsabile della produzione della citotossina diffusibile, ipotesi successivamente confermata utilizzando cavie. L'iniezione di filtrati di colture micobatteriche nell'animale da esperimento ha provocato necrosi simili a quelle delle infezioni umane [4,5,6]. La molecola sospetta è stata successivamente efficacemente isolata, purificata e caratterizzata dalla porzione solubile in acetone degli estratti lipidici di M. ulcerans nel 1999 da George et al. La struttura chimica è stata successivamente risolta come un polichetide denominato mycolactone (ML) [7, 8]. La ML è stata rilevata sulla cromatografia su strato sottile (TLC) come una banda lipidica giallo chiaro, attiva nell'ultravioletto, con un valore del fattore di ritenzione di 0,23 in cloroformio/metanolo/acqua (90:10:1, vol/vol/vol) [7]. Un picco prominente a m/z 765, corrispondente all'addotto di sodio del micolattone, è stato osservato mediante analisi di spettrometria di massa (MS) in condizioni di elettrospray. ML è un macrolide polichetidico ibrido con un anello lattonico a 12 membri al centro, insieme a una catena laterale acilica polinsatura legata con C5-O numerata C1′-C16′ a sud e una catena laterale superiore legata a C costituita dal atomi di carbonio C12-C20. Diversi congeneri del micolattone derivano da differenze nella catena "meridionale", mentre la catena "settentrionale" superiore è invariante. Ulteriori ricerche hanno rivelato che il micolattone ottenuto da M. ulcerans era una combinazione 3:2 dei due stereoisomeri noti come micolattoni A e B, che si formano come isomeri geometrici spontanei attorno al doppio legame in C4′ C5′ (mostrato dalla linea ondulata tra C5′ e C6′) [9, 10] (Fig. 1).